帕乔利的描述非常有意思，因为他那时与列奥纳多交往甚密，因此这段评论可能也反映了列奥纳多本人的观点，即“专注”和“惊愕”的程度，众人把焦点聚集在耶稣身上，以及门徒之间发生的联系。这幅画就这样形成了：人物并不处在一条直线上，而是交错在一起，口中念念有词：“不是我，是另一个人。”
还有就是犹大。他是这幅画的反面人物，但在为准备《最后的晚餐》而作的侧面像习作（温莎皇家图书馆藏）中，犹大是一个比魔鬼还要丑陋的人，几乎就是一个怪物，但他也表现出某种懊悔和自我憎恶的意味，这也使这幅侧面像带有某种悲剧色彩，或准确地说带有基督教的仁爱之意。（最近对这幅画进行的修补恢复了以往修补过程中失去的面部表情的细微之处。修补之后要比修补之前更接近作品初始的样子，这幅犹大侧面像就是个例子。）在听到耶稣的话后，当他的手都已经接近碟子里的面包时，他向后退缩了。关于列奥纳多画的《最后的晚餐》中的犹大的脸，瓦萨里曾讲过一个趣闻：圣玛利亚感恩教堂修道院院长总是催促列奥纳多“尽快完成这项工作”，并向公爵抱怨这个艺术家如何拖延时间。得知此事后，列奥纳多对卢多维科说他还在寻找一个长着极为阴险毒辣的脸的人作犹大的原型，但如果实在找不到合适的脸，“他一定会用那个不够善解人意、缺乏耐心的修道院院长的头部”作为模型。听到这番话之后，公爵顿时狂笑不止，而“那个不幸的修道院院长糊里糊涂地回到家里，还担心在他的花园里工作的工人”。这是瓦萨里讲的趣闻中有一定真实性的一个，至少当时还有人亲眼看到这一幕。这个故事同样也出现在1554年出版的贾姆巴蒂斯塔·吉拉尔迪·辛蒂欧写的《罗马史论》中，而辛蒂欧则是从他的父亲克里斯托福罗·吉拉尔迪那里听来的。克里斯托福罗·吉拉尔迪是费拉拉的外交官，他在米兰的时候跟列奥纳多有私交。吉拉尔迪的这个版本近似于列奥纳多本人的讲话实录：
最后只剩下犹大的头部没有画。众所周知，犹大是一个大叛徒，因此应该用一张能够表现他的全部邪恶品质的脸来描画他……有一年，或者更长的时间，我每天早晨和晚上都去波戈托大街，所有最卑鄙无耻的人都住在那里，他们中大多数人道德败坏。我去那里是希望看到一张适合表现这个邪恶的人的脸。不过直到今天，我还没有找到……如果最后发现我找不到，我将不得不借用这位神父，这位修道院院长的脸。
不管这个故事是否属实，这段文字近似于列奥纳多本人观点的真实记录。这是熟悉他的克里斯托福罗·吉拉尔迪记忆中或者想像中的列奥纳多讲的话：“有一年，或者更长的时间，我每天早晨和晚上都去波戈托大街……”
绘制《最后的晚餐》首先要在修道院餐厅的墙上均匀地涂上一层灰泥，这层灰泥构成壁画的基础。墙壁中间是壁画的主体部分，中间的灰泥要比旁边的灰泥粗糙一些，因为这样灰泥才能与覆于其上的漆层粘合得更加牢固。我们可以看到灰泥与漆层的交界处，那是一条模糊的水平线，靠近用透视法描绘的天花板的中间位置。最近一次修补工作中有一个发现——人们发现《最后的晚餐》草图的痕迹，草图是直接画在灰泥之上的，“极为简洁的红线条，用流畅的画笔描绘上去……按照他的布局勾画出众人的轮廓或外形。”绘上草图之后再打上熟石膏粉或底子。现代的高科技分析显示当时用的石膏粉是“一种小颗粒状的混合物，100－200微米厚，是用类蛋白质将钙碳酸盐和镁粘合而成”，顶层再涂上一层薄薄的铅白色的底漆。在这个阶段，列奥纳多故意在表面留下一些切口，主要是为了勾画出建筑背景的形状和全景；为了追求作品的精确性，图画区域的中心还打上一个小孔，作为整幅壁画的没影点。在放大的照片中能看到这个点：这个点就在耶稣的右太阳穴上。
所有的这些准备工作告诉我们这是一项作坊成员的集体工作（班代洛的记述中遗漏了这一点，使人误以为他在艺术创作时是孤独一人）。米开朗基罗一人包揽了西斯廷教堂壁画的所有工作，但《最后的晚餐》并不是列奥纳多一个人的功劳，他手下还有一帮助手。其中很可能有马可·德奥焦诺，他可能绘制过《最后的晚餐》的最早的临摹画；萨莱当时大约16岁，是列奥纳多的伙计；可能还有托马索·马西尼，有资料证明他后来参与制作一幅大型的壁画（佛罗伦萨的《安加利之战》壁画）。他们是列奥纳多信任的助手，此外他或许收了一些新的学徒和助手，我们可以在《大西洋抄本》的两页纸上看到这些人的名字：
9月8日，约蒂提来了，一个月4达克特。
10月17日，贝内代托到来，一个月4达克特。
这个笔记应该写于1496年或1497年。4达克特是列奥纳多向他们索要的膳食费和住宿费；除了这些费用，作为助手，他们还可以赚一些收入。就这样，到当年年底，贝内代托差不多赚了39里拉——只少于10达克特——差不多正好够支付他的膳食费，为挣这笔钱他花了10个星期的时间。贝内代托的名字也出现在一张未标明日期的笔记上，页边的空白已有部分被剪掉，上面记录了大约同一时期列奥纳多工作室里的人手：