最早可以确定列奥纳多对解剖学产生兴趣的素描和笔记作于15世纪80年代末。这些素描和笔记只是他影响最为深远的一大成就的开端。就他的实际贡献或影响力来说，他在解剖学方面取得的成绩要远大于他在工程、发明和建筑方面的成绩。他绘制的人体图和记录的相关笔记要比前人在这方面的成就更为严格和准确。他的人体解剖素描为揭示人体器官提供了全新的视图，就像他的机械素描与机器的关系一样。进行这种探索需要顽强的意志和勇气，会受到传统禁忌的阻碍和教条主义者的质疑，而且还需要在尸体冷却之前在紧张的时间内，进行令人厌恶的解剖。列奥纳多的解剖活动体现了他“勇于实践”的工作理念，这是对先哲——加伦、希波克拉底和亚里士多德被普遍接受的智慧的剖析和再评价，这三人当时依然是医学派别的主流。
传统观念认为解剖学太过古怪，因为人是按照上帝的样子生出来的，因此不能像机器那样被大卸八块。早期的人文主义者科卢切·萨卢塔蒂就曾写道，解剖学揭示了“自然所一直精心隐藏的东西”，“我不相信如果在看到人体深处的时候，有人能不潸然泪下。”列奥纳多的解剖活动至少有一次使自己与教会发生过对立。那是1515年的罗马，一个居心叵测之人“千方百计阻挠我进行解剖，不仅在教皇面前公开指责我，还在医院里喋喋不休”。
列奥纳多的解剖活动属于科学研究，同时也与艺术领域有着紧密联系，解剖学拉近了科学与艺术的距离，或者表明两者之间根本就不存在什么距离。解剖学同几何学和数学一样，都是绘画的基础。在一幅画出颈部和肩膀神经的解剖图的下面，列奥纳多写道：“这种表现形式对一名优秀的绘画者十分重要，就好比优秀的语法家要知道单词的拉丁文起源一样。”[257]你是否还记得，《最后的晚餐》中列奥纳多用人物的紧绷而又扭曲的颈部肌肉来表现当时戏剧性的一刻。列奥纳多对解剖学的兴趣，就像稍晚一些对光学的兴趣一样，是他从事绘画的必然结果，也许更准确地说是他在米兰作坊向弟子和学徒传授绘画技艺的必然结果。“画家哲学家”的理想观念也随之产生，列奥纳多的艺术是建立在他对描绘之物的深厚的科学知识之上。他也是自此开始发奋撰写小册子和专题文章，这些文章在他死后被收录进他伟大的《论绘画》中。在早期的传记作家看来，研究解剖不完全是件好事。焦维奥确信列奥纳多艺术方面的低产是因为他将大把的时间用来研究“艺术之下的学科”，主要是研究解剖学和光学。瓦萨里也认为在这些领域探索并不重要，最终会削弱他的艺术创作。
列奥纳多应该可能跟韦罗基奥学过解剖。佛罗伦萨15世纪70年代的艺术表现风格，比如安东尼奥·德尔·波莱沃洛的绘画和韦罗基奥的雕塑，都带有强烈的人体解剖的细节和戏剧性。波莱沃洛对人体肌肉曾做过十分细致的研究，这显然是借助解剖进行的，随后他创作了著名的《裸体人大战》。列奥纳多应该知道佛罗伦萨的解剖专家安东尼奥·贝尼维尼，他俩可能还彼此相识，贝尼维尼还是洛伦佐·德·美第奇的朋友。贝尼维尼研究过心脏和其他内部器官的功能，但他主要的兴趣在于在死刑之后解剖尸体，寻找犯罪行为的体内表征。他的专著《隐藏的原因》讲述了他在进行20次这种解剖之后的调查结果。
也许佛罗伦萨还有其他人在解剖学上影响过他，但是列奥纳多对解剖学的兴趣表现得最为强烈的时候还是在米兰。1489年，列奥纳多曾打算出一本关于这方面的“书”，这实际是一本手抄本专著。有一些文字资料可以证明这一点：有一些残留下来的草稿和目录列表，其中一张草稿的写作日期是1489年4月2日。列奥纳多后来给这个计划中的书起名为《论人体的形态》，再一次证明了解剖学与绘画之间的关系。
1489年，36岁的列奥纳多开始思考世界通用的死亡的象征：人的头骨。在藏于温莎皇家图书馆的三页纸张上，他描绘了八幅关于头骨的习作，有侧面图，有截面图，还有从上方斜看头骨的图。这些素描画得巧妙精致，阴影效果优美，神秘怪异。不同的习作选取不同的角度——有画脸部的血管，有的表示眼眶和颚骨之间的关系，还有的是俯看颅骨的空腔，描绘了颅内的神经和血管。但他绘制这些习作的主要兴趣出现在画边的注解上。他的兴趣不在科学研究，而是形而上学方面。其中一幅头骨习作被按比例画成方形，列奥纳多在画边上写着，“a－m线与c－b线相交的地方，就是各种感觉的交汇之所。”
他这里特意强调的“各种感觉交汇之所”就是亚里士多德曾假设的“共通感”。各种感观印象在大脑这个地方得到协调和解释。“共通感”被称为大脑三个“脑室”中最重要的一个，另两个一个是“印象区”，用以收集原始的感观数据，另一个是“记忆区”，用以存储加工后的信息。“脑室”只是指一个地方或腔室，但“共通感”除此之外还有其他作用。打个比方，“共通感”就类似于电脑里的CPU（即中央处理器），两者既是物质实体，又都是抽象的系统。在一些与头骨习作同一时期创作的笔记中，列奥纳多是这样给这一传统理论下定义的：
“共通感”用来判断其他意识所提供的信息。古代的思想家们总结说，人的解释能力来自于一个器官，其他五个意识将所有信息都送到那里……人们说“共通感”处在大脑的中央，位于印象区和记忆区之间。